RESULTADOS:

La prueba COBAS® HPV detecta y discrimina automáticamente 14 genotipos de alto riesgo del HPV (HPV-AR) y/o 12 genotipos de alto riesgo con genotipado individual de HPV 16 y HPV 18 simultáneamente (HPV-GT).

Control de calidad y validez de los resultados en el sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800 con la versión del software 2.0 o posterior:

• Se procesan un cobas® Buffer Negative Control [(-) Ctrl] y un control positivo COBAS® HPV [HPV (+) C] al menos cada 72 horas o con cada lote de kit nuevo. Los controles positivos y/o negativos pueden programarse con mayor frecuencia en función de los procedimientos de laboratorio y/o la reglamentación local.

• Los resultados de los controles se muestran en la app “Controles”.

• En el software y/o el informe, revise los avisos para comprobar la validez de los resultados de la prueba (consulte la Asistencia al usuario de x800 Data Manager para conocer la “Lista de códigos de avisos”).

• Los controles consideran válidos cuando no hay avisos para ninguno de los controles.

• Los controles se marcan como “Válido” en la columna “Resultados del control” cuando las dianas del control correspondiente se han notificado como válidas. Los controles se marcan como “No válido” en la columna “Resultados del control” cuando las dianas del control correspondiente se han notificado como no válidas.

• Los controles marcados como “Invalid” muestran un aviso en la columna “Aviso”. En la vista de detalles podrá encontrar más información sobre el motivo por el que el control se ha notificado como no válido, además de información sobre el aviso.

• Si uno de los controles no es válido, repita el análisis de todos los controles y de todas las muestras asociadas. El software del instrumento realiza automáticamente la validación de los resultados en función de los resultados de los controles.

Nota: El sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 2.0 se suministran con la configuración estándar para el análisis de un conjunto de controles (positivo y negativo) con cada serie, pero se puede modificar por un programa menos frecuente de hasta cada 72 horas según los procedimientos de laboratorio y/o la reglamentación local. Póngase en contacto con su ingeniero técnico de Roche o con el represente del servicio técnico de Roche para obtener más información.

Control de calidad y validez de los resultados en los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 1.4:

• Con cada lote de un tipo de resultado solicitado (HPV-AR o HPV-GT) se procesan un control negativo para el buffer de cobas® [(–) Ctrl] y un control positivo para COBAS® HPV [HPV (+) C].

• Compruebe los avisos y los resultados asociados tanto en el software como en el informe para garantizar la validez del lote.

• Todas los avisos están descritos en la Asistencia al usuario de los sistemas cobas® 6800/8800.

• El lote se considera válido cuando no hay avisos para ninguno de los controles. Si el lote no es válido, repita las pruebas para todo el lote.

El software de los sistemas cobas® 6800/8800 realiza automáticamente la validación de los resultados en función de los resultados de los controles.

Interpretación de los resultados en el sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800 con la versión del software 2.0 o superior:

Los resultados de las muestras se muestran en la app “Resultados” del software. En la Ilustración 3 y la Ilustración 4 se muestran ejemplos de visualización.

Ilustración 3. Ejemplo de visualización de los resultados de la prueba COBAS® HPV para la solicitud de resultados de HPV-AR en el software del sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 2.0 o posterior

Nota: La ilustración es válida para todos los tipos de muestra. El resumen de resultados muestra un símbolo de aviso en caso de resultados no válidos. Encontrará descripciones detalladas de los avisos en los detalles del resultado.

Ilustración 4. Ejemplo de visualización de los resultados de la prueba COBAS® HPV para la solicitud de resultados de HPV-GT en el sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 2.0 o posterior

Nota: La ilustración es válida para todos los tipos de muestra. El resumen de resultados muestra un símbolo de aviso en caso de resultados no válidos. Encontrará descripciones detalladas de los avisos en los detalles del resultado.

Compruebe cada muestra para detectar avisos en el software y/o en el informe. La interpretación de resultados se debe realizar del siguiente modo:

• Las muestras asociadas a controles válidos se muestran como “Válido” en la columna “Resultados de control”.

• Las muestras asociadas a un control erróneo se muestran como “No Válido” en la columna “Resultados de control”.

• Si los controles asociados al resultado de una muestra no son válidos, se añade un aviso específico al resultado de la muestra de la siguiente manera:

• Q05D: Fallo de validación del resultado por un control positivo no válido

• Q06D: Fallo de validación del resultado por un control negativo no válido

• Los valores en la columna “Resultados” para el resultado de la diana de la muestra individual deben interpretarse como se muestra en la Tabla 18 y la Tabla 19.

• Si una o más dianas de la muestra están marcadas como “No válido”, el software muestra un aviso en la columna de avisos. En la vista de detalles podrá encontrar más información sobre el motivo por el que la(s) diana(s) de la muestra se ha notificado como no válidas, además de información sobre el aviso.

• Los resultados no válidos para una o varias combinaciones de dianas son posibles con la solicitud de resultados HPV-GT y se comunican específicamente para cada diana. Consulte las instrucciones de repetición de pruebas para cada tipo de muestra a continuación.

• Los resultados de esta prueba solo deben interpretarse junto con la información disponible de la evaluación clínica del paciente y de su historial.

• En el caso de obtener resultados diana no válidos de muestras conservadas en Roche Cell Collection Medium o PreservCyt®, la muestra original debe volverse a analizar, no más de dos veces, para obtener resultados válidos. Si los resultados siguen siendo no válidos, debe utilizarse una muestra nueva. Para los resultados de la diana no válidos de muestras recogidas en SurePath™, debe repetirse el análisis de la muestra original si hay volumen suficiente. Si los resultados siguen siendo no válidos, debe utilizarse una muestra nueva.

Interpretación de resultados en los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 1.4 o posterior:

En la Ilustración 5 y la Ilustración 6 se muestran ejemplos de visualización de la prueba COBAS® HPV para los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 1.4 o posterior.

Ilustración 5. Ejemplo de visualización de los resultados de la prueba COBAS® HPV para la solicitud de resultados de HPV-AR para los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 1.4 o posterior

Nota: Las columnas Diana 2 y Diana 3 están reservadas para los resultados de HPV16 y HPV18 con solicitud de HPV-GT, respectivamente.

Ilustración 6. Ejemplo de visualización de los resultados de la prueba COBAS® HPV para la solicitud de resultados de HPV-GT para los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 1.4 o posterior

En los lotes válidos, compruebe cada muestra para detectar avisos en la versión del software 1.4 y/o en el informe de los sistemas cobas® 6800/8800. La interpretación de resultados se debe realizar del siguiente modo:

• Un lote válido puede incluir resultados de muestras tanto válidos como no válidos.

• Las columnas “Válido” y “Resultado general” no son aplicables a los resultados de las muestras de la prueba COBAS® HPV y aparecen marcadas como “NA”. Los valores que aparecen en estas columnas no influyen en la validez de los resultados comunicados en las columnas de resultados de dianas individuales.

• Los resultados comunicados de las dianas para muestras individuales son válidos a no ser que se indiquen como “Invalid” en la columna de resultado de diana individual.

• Los resultados no válidos para una o varias combinaciones de dianas son posibles con la solicitud de resultados HPV-GT y se comunican específicamente para cada diana. Consulte las instrucciones de repetición de pruebas para cada tipo de muestra a continuación.

• En el caso de obtener resultados diana no válidos de muestras conservadas en Roche Cell Collection Medium PreservCyt®, la muestra original debe volverse a analizar, no más de dos veces, para obtener resultados válidos. Si los resultados siguen siendo no válidos, debe utilizarse una muestra nueva. Para los resultados de la diana no válidos de muestras recogidas en SurePath™, debe repetirse el análisis de la muestra original si hay volumen suficiente. Si los resultados siguen siendo no válidos, debe utilizarse una muestra nueva.

Interpretación de los resultados en los sistemas cobas® 5800/6800/8800:

A continuación se muestran los resultados y la interpretación correspondiente para la detección únicamente de genotipos AR de HPV (Tabla 18) y para la detección de otros genotipos AR de HPV, HPV 16 y HPV 18 (Tabla 19).

Tabla 18. Resultados de la prueba COBAS® HPV e interpretación para la solicitud del resultado HPV-AR

Tabla 19. Resultados de la prueba COBAS® HPV e interpretación de la solicitud de resultado HPV-GT

USO PREVISTO:

La prueba COBAS® HPV para uso en los sistemas cobas® 5800/6800/8800 (COBAS® HPV) es una prueba cualitativa automatizada in vitro para la detección de ADN del virus del papiloma humano (HPV) en muestras de pacientes.

La prueba utiliza la amplificación del fragmento de ADN diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de 14 genotipos del HPV de alto riesgo (AR) en un único análisis. La prueba identifica específicamente los genotipos HPV16 y HPV18, además de detectar simultáneamente el resto de los tipos de alto riesgo (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) en niveles de infección clínicamente relevantes. Las muestras se limitan a células cervicales recogidas en Roche Cell Collection Medium (Roche Molecular Systems, Inc.), solución PreservCyt® (Hologic Corp.) y fluido conservante SurePath™ (BD Diagnostics-TriPath).

Indicaciones de uso de la prueba COBAS® HPV:

A. La prueba COBAS® HPV está indicada para el cribado de pacientes en cuyos resultados de la citología cervical se han detectado células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS) a fin de determinar si es necesario realizar una colposcopia.

B. La prueba COBAS® HPV está indicada para el cribado de pacientes en cuyos resultados de la citología cervical se han detectado ASCUS con objeto de valorar la presencia o ausencia de los genotipos de alto riesgo 16 y 18 del HPV.

C. La prueba COBAS® HPV está indicada para su uso conjunto con una citología cervical para valorar la presencia o ausencia de tipos de alto riesgo del HPV.

D. La prueba COBAS® HPV está indicada para su uso conjunto con una citología cervical para valorar la presencia o ausencia de los genotipos 16 y 18 del HPV.

E. La prueba COBAS® HPV está indicada para su uso como una prueba de cribado primario de primera línea para identificar mujeres con riesgo elevado de desarrollar cáncer cervical o que ya presentan la enfermedad de alto grado.

F. La prueba COBAS® HPV está indicada para su uso como una prueba de cribado primario de primera línea con objeto de valorar la presencia o ausencia de los genotipos 16 y 18 del HPV.

La prueba COBAS® HPV también puede utilizarse con muestras vaginales de autotoma según las instrucciones del personal sanitario recogidas en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt®.

Los resultados obtenidos con la prueba COBAS® HPV, junto con la valoración médica de la historia citológica, otros factores de riesgo y las directrices profesionales, pueden utilizarse como ayuda en la gestión de las pacientes. Los resultados de la prueba COBAS® HPV no tienen como finalidad evitar que las mujeres se sometan a una colposcopia.

OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS:

Nota: Manipule todas las muestras y los controles como si pudieran transmitir agentes infecciosos.

Obtención de las muestras:

Se ha validado el uso de muestras cervicales recogidas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™ con la prueba COBAS® HPV.

Las muestras vaginales recogidas con FLOQSwabs® para autotoma vaginal y suspendidas en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt® Solution han sido validadas para su uso con la prueba COBAS® HPV.

Las muestras vaginales recogidas con Evalyn® Brush y suspendidas en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt® han sido validadas para su uso con la prueba COBAS® HPV.

Siga las instrucciones del fabricante para obtener las muestras.

Transporte de las muestras:

Las muestras recogidas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® o fluido conservante SurePath™ se pueden transportar a una temperatura comprendida entre 2 y 30°C. El transporte de las muestras del HPV debe cumplir las reglamentaciones nacionales, federales, estatales y locales para el transporte de agentes etiológicos.27

Almacenamiento de las muestras:

Las muestras recogidas en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt® pueden conservarse a una temperatura comprendida entre 2 y 30°C durante 3 meses tras la fecha de obtención antes de realizar la prueba COBAS® HPV. Consulte la etiqueta de Roche Cell Collection Medium para conocer los requisitos de almacenamiento del medio. Consulte la etiqueta de la solución PreservCyt® para conocer los requisitos de almacenamiento del medio. No congele las muestras recogidas en Roche Cell Collection Medium y PreservCyt®.

Las muestras recogidas en fluido conservante SurePath™ deben someterse a un tratamiento con buffer de preparación de muestras cobas® Sample Prep Buffer (CSPB) para revertir la reticulación inducida por la matriz antes de realizar la prueba de HPV. El tratamiento preanalítico es un paso obligatorio para todas las muestras cervicales recogidas en SurePath™ antes realizar la prueba COBAS® HPV. No congele las muestras recogidas en solución SurePath™.

Los viales primarios de muestras cervicales recogidas en fluido conservante SurePath™ pueden conservarse hasta 3 meses a una temperatura comprendida entre 2 y 8°C o hasta 6 semanas a una temperatura comprendida entre 15 y 30°C tras la fecha de obtención. Las muestras recogidas en SurePath™ pueden mezclarse con buffer de preparación de muestras cobas® en un tubo secundario y almacenarse a 2-30°C hasta 6 semanas antes de completar el paso de calentamiento, tal como se describe en el apartado “Muestras en fluido conservante SurePath™”. Asimismo, las muestras recogidas en SurePath™ también pueden almacenarse a 2-30°C hasta 6 semanas después de su precalentamiento, tal como se describe en el apartado “Muestras en fluido conservante SurePath™”, antes de realizar la prueba del HPV.

Tabla 15. Resumen de las condiciones de almacenamiento aceptables para las muestras antes de realizar la prueba COBAS® HPV

* Una botella abierta del buffer de preparación de muestras cobas® Sample Prep Buffer (CSPB) puede almacenarse a temperatura ambiente (15-30°C) hasta 21 días y utilizarse hasta 4 veces distintas para el tratamiento preanalítico de las muestras SurePath™.

PRECAUCIONES Y REQUISITOS DE MANIPULACIÓN:

Advertencias y precauciones:

Como sucede con cualquier procedimiento de prueba, resulta esencial seguir las buenas prácticas de laboratorio recomendadas para obtener un rendimiento correcto del ensayo. Debido a la elevada sensibilidad de esta prueba, deben extremarse las precauciones para evitar cualquier tipo de contaminación de los reactivos y las mezclas de amplificación.

• Para diagnóstico in vitro exclusivamente.

• Las muestras vaginales de autotoma deben estar suspendidas en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt® después de la recogida de la muestra.

• Pueden obtenerse resultados falsos negativos o no válidos con muestras de autotoma si las muestras no se suspenden en medio después de la recogida.

• Todas las muestras de pacientes deben tratarse como si fueran infecciosas, utilizando los procedimientos de laboratorio recomendados que se describen en la publicación Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories25y en el documento M29-A4 del CLSI.26 Este procedimiento solamente debería llevarlo a cabo personal experto en la manipulación de material biopeligroso y en el uso de la prueba COBAS® HPV, el sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800.

• Todos los materiales de origen humano deben considerarse potencialmente infecciosos y manipularse teniendo en cuenta las precauciones generales. En caso de que se produzca un derrame, desinfecte de inmediato con una solución recién preparada de hipoclorito de sodio o potasio al 0,5% en agua destilada o desionizada o siga los procedimientos apropiados del laboratorio.

• No congele ninguna muestra almacenada en tubos primarios o secundarios.

• Utilice solo el material fungible suministrado o que se requiera expresamente para garantizar el rendimiento establecido para la prueba.

• Puede solicitar ficha de datos de seguridad (Safety Data Sheets, SDS) al representante local de Roche.

• Siga al pie de la letra los procedimientos y las directrices que se suministran para garantizar la correcta realización de la prueba. Cualquier variación de dichos procedimientos y directrices podría afectar el rendimiento establecido para la prueba.

• Podrían producirse resultados falsos positivos si no se evita la contaminación por arrastre de las muestras durante la manipulación y el procesamiento de las mismas.

• Informe a la autoridad competente local y al fabricante de cualquier incidente grave que pueda tener lugar durante la realización del ensayo.

Manipulación de reactivos:

• Manipule todos los reactivos, controles y muestras de acuerdo con las mejores prácticas de laboratorio para evitar la contaminación por arrastre de las muestras, los reactivos o los controles.

• Antes de utilizarlos, revise cada casete de reactivo, diluyente, reactivo de lisis y reactivo de lavado para asegurarse de que no hay signos de fugas. No utilice el material si hay alguna evidencia de fuga.

• El cobas® omni Lysis Reagent contiene tiocianato de guanidina, una sustancia química potencialmente peligrosa. Evite el contacto de reactivos con la piel, los ojos o las membranas mucosas. En caso de contacto, lave inmediatamente la zona afectada con abundante agua para evitar quemaduras.

• No permita que el cobas® omni Lysis Reagent, que contiene tiocianato de guanidina, entre en contacto con la solución de hipoclorito de sodio o de potasio. Tales mezclas pueden producir gases de alta toxicidad.

Los kits de control usados contienen viales perforados con reactivo residual. Extreme la precaución durante su eliminación para evitar derrames y el contacto.

• La prueba COBAS® HPV, el COBAS® HPV Positive Control Kit, el cobas® Negative Control Kit, el cobas® omni MGP Reagent y el cobas® omni Specimen Diluent contienen azida sódica como conservante. Evite el contacto de reactivos con la piel, los ojos o las membranas mucosas. En caso de contacto, lave inmediatamente la zona afectada con abundante agua para evitar quemaduras. Si se producen salpicaduras de reactivos, diluya las manchas con agua antes de secarlas con un paño. La azida sódica puede reaccionar con las tuberías de plomo o cobre y formar azidas metálicas muy explosivas. Si elimina soluciones que contienen azida sódica vertiéndolas en fregaderos de laboratorio, deje correr abundante agua fría para evitar la formación de depósitos de azida.

• Elimine todos los materiales que hayan estado en contacto con las muestras y los reactivos de acuerdo con la reglamentación nacional, estatal y local.

Buenas prácticas de laboratorio:

• No pipetee con la boca.

• No se debe comer, beber ni fumar en las áreas de trabajo.

• Utilice guantes de laboratorio, bata de laboratorio y protección ocular cuando manipule las muestras y los reactivos. Evite la contaminación de los guantes durante la manipulación de las muestras y de los controles. Es necesario cambiarse los guantes entre la manipulación de las muestras y la prueba COBAS® HPV, el COBAS® HPV Positive Control Kit, el cobas® Buffer Negative Control Kit y los reactivos cobas® omni para evitar la contaminación.

• Lávese bien las manos después de manipular las muestras y los reactivos, y al quitarse los guantes.

• Limpie y desinfecte minuciosamente todas las superficies de trabajo del laboratorio usando una solución recién preparada de hipoclorito de sodio o potasio al 0,5% en agua destilada o desionizada. A continuación, límpielas con un trapo impregnado en etanol al 70%.

• Si el derrame se produce sobre un instrumento cobas® 5800 o los instrumentos cobas® 6800/8800, siga las instrucciones descritas en la Asistencia al usuario o del sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800 para limpiar y descontaminar correctamente la superficie de los instrumentos.

REACTIVOS Y MATERIALES:

Reactivos y controles de COBAS® HPV:

Tabla 1 COBAS® HPV

Almacenar a 2-8°C

Casete para 480 pruebas (P/N 09040544190)

Tabla 2. COBAS® HPV Positive Control Kit

Almacenar a 2-8°C (P/N 09040552190)

Tabla 3. cobas® Buffer Negative Control Kit

Almacenar a 2-8°C (P/N 09051953190)

Reactivos cobas® omni para la preparación de muestras:

Tabla 4. Reactivos cobas® omni para la preparación de muestras*

* Estos reactivos no están incluidos en el kit de la prueba COBAS® HPV. Consulte el listado de material adicional necesario (Tabla 8 y Tabla 9).

** Las etiquetas de seguridad del producto se basan fundamentalmente en la regulación GHS de la UE.

*** Sustancia peligrosa.

Requisitos de almacenamiento y manipulación de los reactivos:

Los reactivos deben almacenarse y manipularse según las indicaciones de la Tabla 5, la Tabla 6 y la Tabla 7.

Cuando los reactivos no están cargados en el sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800, almacénelos a la temperatura correspondiente especificada en la Tabla 5.

Tabla 5. Almacenamiento de reactivos (cuando el reactivo no está cargado en el sistema)

Requisitos para la manipulación de reactivos en el sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800: Los reactivos cargados en el sistema cobas® 5800 o en los sistemas cobas® 6800/8800 se almacenan a la temperatura correspondiente adecuada y el sistema controla y aplica su fecha de caducidad. El sistema solamente permite utilizar los reactivos cuando se cumplen todas las condiciones indicadas en la Tabla 6, la Tabla 7 y la Tabla 8. El sistema evita automáticamente el uso de reactivos caducados. La información sobre la estabilidad restante del kit abierto y el número de usos del kit para los reactivos específicos del ensayo está disponible a través de la interfaz de usuario del sistema.

Tabla 6. Condiciones de caducidad de los reactivos monitorizadas y aplicadas por el sistema cobas® 5800

Tabla 7. Condiciones de caducidad de los reactivos controladas y aplicadas por los sistemas cobas® 6800/8800

La Tabla 8 muestra la estabilidad del kit abierto de los reactivos cobas® omni. Antes de cada serie, el sistema verifica la estabilidad del kit abierto y procura un volumen de llenado suficiente. Por lo tanto, estos reactivos no tienen asignado un número de usos del kit o un periodo de estabilidad.

Tabla 8. Condiciones de caducidad de los reactivos cobas® omni aplicadas por los sistemas cobas® 5800/6800/8800

Material adicional necesario para los sistemas cobas® 5800/6800/8800:

Tabla 9. Materiales para el uso en los sistemas cobas® 5800/6800/8800

Tabla 10. Material fungible para el uso en el sistema cobas® 5800*

*Para conocer los números de referencia, consulte la Asistencia al usuario de los sistemas cobas® 5800

Tabla 11. Material fungible para el uso en los sistemas cobas® 6800/8800

* Para conocer los números de referencia, consulte la Asistencia al usuario de los sistemas cobas® 6800/8800

Instrumentos y software necesarios:

Es necesario instalar el software cobas® 5800, el software de los sistemas cobas® 6800/8800 y los paquetes de análisis COBAS® HPV (ASAP) para los sistemas cobas® 5800/6800/8800 en los instrumentos.

Para el sistema cobas® 5800 y los sistemas cobas® 6800/8800 con versión del software 2.0 o posterior, el software x800 Data Manager y el PC (o servidor) se suministran con el sistema.

Para la versión del software 1.4 de los sistemas cobas® 6800/8800, el servidor IG (Instrument Gateway) se suministra con el sistema.

Tabla 12. Instrumentos

Consulte la Asistencia al usuario del sistema cobas® 5800 o de los sistemas cobas® 6800/8800 para obtener información adicional.

Material adicional necesario para la recogida de muestras para COBAS® HPV:

Tabla 13. Kits de obtención de muestras para la prueba COBAS® HPV

Consulte la Asistencia al usuario o las Guías del usuario del sistema cobas® 5800 o de los sistemas cobas® 6800/8800 para obtener información adicional sobre los tubos primarios y secundarios compatibles con cada instrumento.

Nota: póngase en contacto con su representante local de Roche para obtener una lista de pedido detallada para racks de muestras, racks para puntas obstruidas y bandejas de racks compatibles con cada instrumento.

Material adicional para la preparación de muestras:

Tabla 14. Materiales para la preparación de muestras para la prueba COBAS® HPV

* Una botella abierta del buffer de preparación de muestras cobas® Sample Prep Buffer (CSPB) puede almacenarse a temperatura ambiente (15-30°C) hasta 21 días y utilizarse hasta 4 veces distintas para el tratamiento preanalítico de las muestras SurePath™.

a Se necesitan racks RD5 o MPA junto con el transportador de racks de 5 posiciones en el sistema cobas® 5800.

b El rack MPA de 16 mm o el transportador de tubos de 16 posiciones son los racks preferidos para uso con muestras recogidas en tubos secundarios cobas®.

c Los racks MPA o RD5 identificados son material de ejemplo y números de referencia. Póngase en contacto con su representante local de Roche para obtener una lista de pedido detallada para racks de muestras y transportadores de racks compatibles con cada instrumento.

EVALUACIÓN NO CLÍNICA DEL RENDIMIENTO:

Se ha demostrado que el rendimiento de las muestras cervicales recogidas en Roche Cell Collection Medium es comparable al de las muestras cervicales recogidas en solución PreservCyt®. Las pruebas de rendimiento con muestras cervicales recogidas en fluido conservante SurePath™ se han realizado utilizando un tratamiento con buffer de preparación de muestras cobas®. Todas las concentraciones incluidas en los estudios siguientes se refieren a la muestra SurePath™ tratada.

Equivalencia entre sistemas/Comparación de sistemas: La equivalencia entre los sistemas cobas® 5800, cobas® 6800 y los cobas® 8800 se demostró a partir de estudios de rendimiento.

Los resultados incluidos en las Instrucciones de uso hacen patente la equivalencia de rendimiento entre todos los sistemas.

Características clave de rendimiento:

Límite de detección (LoD):

Se evaluó el LoD para HPV16 y HPV18 utilizando líneas celulares SiHa y HeLa como referencia para muestras de pacientes negativas para el HPV con pooles recogidas en solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™. Las líneas celulares se diluyeron en concentraciones inferiores y superiores a los niveles del LoD esperado. Se analizaron un mínimo de 24 réplicas para cada nivel de línea celular tanto en solución PreservCyt® como en fluido conservante SurePath™ a partir de 3 lotes de reactivos con el mismo número de series realizadas en el sistema cobas® 6800 y los sistemas cobas® 8800. Se definió el LoD como el nivel de células del HPV de la muestra que ofrece resultados positivos como mínimo en un 95% de las ocasiones con todas las concentraciones superiores que presentan resultados positivos en más del 95% de las ocasiones.

El LoD para SiHa fue de 16 células/mL tanto para PreservCyt® como para SurePath™; el LoD para HeLa fue de 16 células/mL en PreservCyt® y de 8 células/mL en SurePath™. Tabla 24 a la Tabla 25 se presentan los resultados de los lotes de reactivos cuyo nivel del LoD es más conservador (más alto) para el análisis de HPV16 y HPV18 en solución PreservCyt® y en fluido conservante SurePath™, respectivamente.

Se analizaron en paralelo los paneles de dilución de las líneas celulares de HPV16 y HPV18 como referencia de pooles de muestras de pacientes negativas para el HPV recogidas en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt®. El límite de detección obtenido para la prueba COBAS® HPV es equiparable.

Tabla 24. Niveles del límite de detección para HPV16 (línea celular SiHa) en solución PreservCyt®

Tabla 25. Niveles del límite de detección para HPV16 (línea celular SiHa) en fluido conservante SurePath™

Tabla 26. Niveles del límite de detección para HPV18 (línea celular HeLa) en solución PreservCyt®

Tabla 27. Niveles del límite de detección para HPV18 (línea celular HeLa) en fluido conservante SurePath™

Inclusividad:

Se evaluaron los plásmidos para los genotipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68 de alto riesgo como referencia para muestras de pacientes negativas para el HPV con pooles recogidas en solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™. El ensayo detectó los 12 genotipos de alto riesgo analizados

Precisión:

Se evaluó la precisión intralaboratorio mediante un panel con miembros compuestos a partir de líneas celulares del HPV o muestras clínicas positivas para el HPV diluidas en una matriz de pool de muestras cervicales negativas conservadas en solución PreservCyt® y una matriz de pool de muestras cervicales negativas conservadas en fluido conservante SurePath™.

El panel de precisión se diseñó para incluir miembros con concentraciones muy bajas, bajas y medias de HPV (negativo alto, < LoD, ~ LoD y > LoD), así como muestras negativas para el HPV para cada tipo de muestra. El análisis se realizó con tres lotes de reactivos de la prueba COBAS® HPV en dos instrumentos. Se realizaron el mismo número de series en el sistema cobas® 6800 y el sistema cobas® 8800 durante 12 días hasta obtener un total de 24 series para cada miembro del panel. En la Tabla 28 y en la Tabla 29 se muestran una descripción de los paneles de precisión y las tasas de aciertos observadas.

Todos los miembros del panel analizados obtuvieron las tasas de aciertos esperadas. En el análisis de la desviación estándar y el porcentaje del coeficiente de variación de los valores de Ct de los ensayos válidos realizados con los miembros del panel positivos se obtuvieron rangos de CV (%) globales comprendidos entre el 4,32% y el 6,34% para otros genotipos del HPV de alto riesgo (Tabla 30), entre el 1,09% y el 4,61% para HPV16 (Tabla 31) y entre el 1,21% y el 3,76% para HPV18 (Tabla 32).

También se evaluó la precisión intralaboratorio mediante paneles preparados mediante la adición de líneas celulares SiHa y HeLa a los pooles de referencia de muestras de pacientes negativas para el HPV recogidas en Roche Cell Collection Medium con niveles de LoD iguales o superiores. El análisis de los paneles preparados con Roche Cell Collection Medium ofrece una precisión comparable a la de los paneles preparados con solución PreservCyt®.

Tabla 28. Resumen de la precisión intralaboratorio en solución PreservCyt®

IC = Intervalo de confianza, LI = Límite inferior, LS = Límite superior

Tabla 29. Resumen de la precisión intralaboratorio en fluido conservante SurePath™

IC = intervalo de confianza, LI = límite inferior, LS = límite superior

Tabla 30. Media global, desviaciones estándar y coeficientes de variación (%) para el ciclo límite - Otros genotipos del HPV de alto riesgo

Tabla 31 . Media global, desviaciones estándar y coeficientes de variación (%) para el ciclo umbral - HPV16

Tabla 32. Media global, desviaciones estándar y coeficientes de variación (%) para el ciclo límite - HPV18

Especificidad analítica/reactividad cruzada:

Se analizó un panel de bacterias, hongos y virus (incluidos los virus de mayor presencia en el tracto urogenital femenino, así como varios tipos de virus del papiloma humano clasificados de riesgo bajo o indeterminados) con la prueba COBAS® HPV a fin de valorar la especificidad analítica de la misma. Se añadieron los organismos indicados en la Tabla 33, con concentraciones de aproximadamente 1 x 106 unidades*/mL para las bacterias y de aproximadamente 1 x 105 unidades*/mL para los virus a pooles de muestras cervicales negativas para el HPV recogidas en solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™. Se analizaron todos los posibles organismos interferentes de forma individual, así como mezclados con líneas celulares de SiHa (HPV16) y HeLa (HPV18) con una concentración de aproximadamente 3x LoD. Los resultados indicaron que ninguno de estos organismos interfirió en la detección del ADN de HPV16 y HPV18 ni generó ningún resultado falso positivo en la muestra negativa para el HPV.

* Todas las bacterias se cuantificaron como unidades formadoras de colonias (UFC), a excepción de la Chlamydophila psittaci, que se cuantificó como cuerpos elementales (CE). Todos los virus se cuantificaron como unidades/mL, según lo establecido en el ensayo de punto final de la dilución TCID50, a excepción del virus Epstein Barr, que se cuantificó en copias/mL. El Trichomonas vaginalis se cuantificó como células/mL.

Tabla 33. Microorganismos analizados para la especificidad analítica/reactividad cruzada

Interferencia:

Se analizaron los efectos de sustancias endógenas y exógenas que pueden estar presentes en muestras cervicales para valorar su posible interferencia. Para el análisis de interferencia se analizaron todas las posibles sustancias interferentes de forma individual, así como mezcladas con líneas celulares SiHa (HPV16) y HeLa (HPV18) con una concentración de aproximadamente 3x LoD en pooles de muestras cervicales negativas para el HPV recogidas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™.

Las sustancias endógenas analizadas fueron moco cervical, células mononucleares de sangre periférica y sangre total. En la Tabla 34 se muestran los niveles de sustancias endógenas toleradas por el ensayo para los tipos de muestras. En el análisis de sustancias exógenas se incluyeron los 17 productos de higiene femenina disponibles en el mercado y con receta recogidos en la Tabla 35. De entre los productos de higiene femenina disponibles en el mercado y con receta analizados, se obtuvieron resultados falsos negativos con el gel de Metronidazol, Replens™, el gel eliminador de olor vaginal RepHresh™ y el kit de higiene femenina RepHresh™ Clean Balance™. Estos productos pueden contener carbómeros. Se ha demostrado que los productos que contienen carbómeros generan resultados falsos negativos y no válidos. La Tabla 35 no debe considerarse una lista exhaustiva de productos que contienen carbómeros.

También se analizó la posible interferencia con la presencia de ácido acético glacial en pooles de muestras cervicales negativas para el HPV y positivas para el HPV recogidas en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt®. El ensayo admite concentraciones inferiores o iguales a un 5% (v/v) de ácido acético glacial.

Tabla 34. Resumen de concentraciones de sustancias endógenas que no afectan al rendimiento

* “Presencia” significa la cantidad de moco cervical retirada normalmente del cérvix antes de obtener la muestra.

Tabla 35. Lista de sustancias analizadas para detectar interferencias en muestras cervicales

* El gel vaginal de Metronidazol, Replens™, el gel eliminador de olor vaginal RepHresh™ y el kit de higiene femenina RepHresh™ Clean Balance™ mostraron niveles de interferencia que pueden estar presentes en muestras clínicas.

** Las concentraciones ≤5%(v/v) de ácido acético glacial no mostraron interferencias. El análisis del ácido acético glacial se realizó en muestras cervicales recogidas únicamente en solución PreservCyt®.

Contaminación por arrastre:

Se realizaron diversos estudios para evaluar la posible contaminación por arrastre en los sistemas cobas® 6800/8800 que utilizan la prueba COBAS® HPV. El estudio de rendimiento ha determinado que la contaminación por arrastre entre muestras de la prueba COBAS® HPV es del 0,139% (1/719) tras realizar varias series para analizar tanto muestras positivas muy altas que representan más del 95% de los positivos en la población de uso prevista como muestras negativas. Se ha determinado una contaminación por arrastre entre series del 0% (0/470). El análisis se efectuó con muestras preparadas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™.

Fallo de todo el sistema:

Las muestras analizadas en el estudio de fallo de todo el sistema se agruparon en muestras cervicales clínicas negativas para el HPV recogidas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™. A cada pool de muestras clínicas se añadió células SiHa (HPV16) y células HeLa (HPV18) con una concentración de aproximadamente 3x LoD para cada tipo de muestra. Los resultados de este estudio determinaron que la tasa de positividad superó el 99% para Roche Cell Collection Medium, para la solución PreservCyt® y para el fluido conservante SurePath™.

Correlación de métodos:

El rendimiento de la prueba COBAS® HPV se comparó con el de la prueba cobas® 4800 HPV mediante muestras cervicales recogidas en solución PreservCyt® y muestras cervicales recogidas en fluido conservante SurePath™. Todas las muestras recogidas en SurePath™ se trataron con buffer de preparación de muestras cobas® de acuerdo con el método preanalítico definido para cada prueba.

Para este estudio de correlación, se analizaron un total de 6.961 muestras cervicales recogidas en solución PreservCyt® y 5.755 muestras cervicales recogidas en fluido conservante SurePath™.

Los resultados de correlación y las concordancias de porcentajes de positivos, de negativos y general junto con los intervalos de confianza al 95% se muestran en la Tabla 36 para muestras recogidas en PreservCyt® y en la Tabla 37 para muestras recogidas en SurePath™. Hubieron 397 muestras discordantes para genotipos de HPV de alto riesgo para los dos tipos de muestra, combinados; de ellas, 212 fueron positivas con la prueba COBAS® HPV y 185 fueron positivas con la prueba cobas® 4800 HPV.

Tabla 36. Correlación entre la prueba COBAS® HPV y la prueba cobas® 4800 HPV para muestras cervicales recogidas en solución PreservCyt®

Concordancias de la detección de HPV16/HPV18 entre la prueba COBAS® HPV y la prueba cobas® 4800 HPV (estimación e intervalo de confianza del 95%): PCP: 99,5% (97,2%-99,9%); PCN: 98,6% (98,2%-98,8%); y PCG: 98,6% (98,3%-98,8%)

Tabla 37. Correlación entre la prueba COBAS® HPV y la prueba cobas® 4800 HPV para muestras cervicales recogidas en fluido conservante SurePath™

Concordancias de la detección de HPV16/HPV18 entre la prueba COBAS® HPV y la prueba cobas® 4800 HPV (estimación e intervalo de confianza del 95%): PCP: 97,7% (94,3%-99,1%); PCN: 99,0% (98,7%-99,3%); y PCG: 99,0% (98,7%-99,2%).

Comparación del rendimiento de la prueba con Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt®:

Se compararon los resultados de la prueba COBAS® HPV con muestras cervicales recogidas en Roche Cell Collection Medium y muestras cervicales recogidas en solución PreservCyt®. Las muestras cervicales se obtuvieron de los mismos sujetos y luego se recogieron con Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt® siguiendo un orden aleatorio para su posterior análisis. Las muestras positivas para cualquiera de los 14 genotipos de alto riesgo del HPV detectados por la prueba (HPV-AR) se consideraron positivas, mientras que las muestras con resultados negativos para los 14 genotipos de alto riesgo del HPV detectados por la prueba se consideraron negativas.

Se comparó el rendimiento de la prueba COBAS® HPV con Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt® mediante la prueba de proporciones de dos muestras. Los intervalos de confianza del 95% para la diferencia de las proporciones (Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt®) tanto para positivos como para negativos del HPV incluían “0”, lo que confirmó que los resultados para muestras cervicales recogidas en Roche Cell Collection Medium no eran estadísticamente diferentes de los resultados obtenidos para muestras cervicales recogidas en solución PreservCyt® (Tabla 38).

Tabla 38. Prueba de proporciones de dos muestras para muestras cervicales recogidas en Roche Cell Collection Medium y muestras cervicales recogidas en solución PreservCyt®

Correlación de resultados de muestras de autotoma recogidas utilizando FLOQSwab® 552C.80 y muestras recogidas por personal médico:

Se realizó una comparación de los resultados de las muestras vaginales de autotoma y las muestras cervicales recogidas por personal médico utilizando pares de muestras de 744 mujeres seleccionadas para el cribado. Cada mujer recogió primero su muestra utilizando FLOQSwab® 552C.80 (Copan, Italia) y la suspendió en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt® después de la recogida. El personal médico recogió una segunda muestra durante la misma visita utilizando el estándar del protocolo de atención; la muestra recogida por el personal médico se suspendió en el mismo tipo de medio que la muestra de autotoma.

La tasa de resultados no válidos para los resultados de las muestras de autotoma y las recogidas por personal médico fue del 4,7% y del 0,4%, respectivamente. Para el análisis de correlación se utilizó un total de 706 resultados emparejados válidos. Las muestras positivas para cualquiera de los 14 genotipos de alto riesgo del HPV detectados por la prueba (HPV- AR) se consideraron positivas, mientras que las muestras con resultados negativos para los 14 genotipos de alto riesgo del HPV detectados por la prueba se consideraron negativas.

Los resultados de correlación y las concordancias de porcentajes de positivos, de negativos y general junto con los intervalos de confianza al 95% se muestran en la Tabla 39.

Tabla 39. Correlación de resultados de muestras de autotoma vaginal utilizando FLOQSwab® 552C.80 y muestras cervicales recogidas por personal médico

Correlación de resultados de muestras de autotoma recogidas utilizando Evalyn® Brush y muestras recogidas por personal médico:

Se realizó una comparación de los resultados de las muestras vaginales de autotoma y las muestras cervicales recogidas por personal médico utilizando pares de muestras de 784 mujeres seleccionadas para el cribado.

Cada mujer recogió primero su muestra utilizando un cepillo Evalyn® Brush (Rovers, Países Bajos) y la resuspendió en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt® después de la recogida. El personal médico recogió una segunda muestra durante la misma visita utilizando el estándar del protocolo de atención; la muestra recogida por el personal médico se suspendió en el mismo tipo de medio que la muestra de autotoma.

La tasa de resultados no válidos para los resultados de las muestras de autotoma y las recogidas por personal médico fue del 4,7% y del 0,4%, respectivamente. Para el análisis de correlación se utilizó un total de 744 resultados emparejados válidos. Las muestras positivas para cualquiera de los 14 genotipos de alto riesgo del HPV detectados por la prueba (HPV-AR) se consideraron positivas, mientras que las muestras con resultados negativos para los 14 genotipos de alto riesgo del HPV detectados por la prueba se consideraron negativas.

Los resultados de correlación y las concordancias de porcentajes de positivos, de negativos y general junto con los intervalos de confianza al 95% se muestran en la Tabla 40.

Tabla 40. Correlación de resultados de muestras vaginales de autotoma obtenidas utilizando Evalyn® Brush y muestras cervicales obtenidas por personal médico

RENDIMIENTO CLÍNICO CON MUESTRAS CLÍNICAS:

Se analizaron muestras procedentes de una cohorte de población, prospectiva y multicéntrica en un estudio diseñado para evaluar el rendimiento de la prueba COBAS® HPV en la identificación de enfermedades del tejido cervical de alto grado (CIN2, CIN3, cáncer cervical o adenocarcinoma in situ [ACIS]). Los participantes en el estudio representaban una población de cribado general con valoración de histología basada en un panel de revisión de patologías centralizado (CPRP). Las mujeres susceptibles de participar tenían una edad comprendida entre 25 y 65 años, se estaban sometiendo a un cribado de cáncer cervical de rutina, habían firmado un consentimiento informado y satisfacían los criterios de inclusión/exclusión del estudio. Se recogieron dos muestras cervicales: la primera en fluido conservante SurePath™ y la segunda en solución PreservCyt®. Se realizaron tres pruebas por cada sujeto y tipo de muestra: la prueba de citología Pap, la prueba COBAS® HPV para uso en los sistemas cobas® 6800/8800 y la prueba cobas® 4800 HPV.

A las mujeres que obtuvieron un resultado ≥ ASCUS en la citología de la muestra recogida en SurePath™ se les recomendó someterse a una colposcopia. Asimismo, todas las mujeres con un resultado positivo para ADN de HPV de alto riesgo (positivo mediante la prueba cobas® 4800 HPV), así como un subconjunto elegido aleatoriamente de mujeres con citología NILM (negativo para lesión intraepitelial o malignidad) y negativa para ADN de HPV de alto riesgo (mediante la prueba cobas® 4800 HPV), fueron seleccionadas para continuar con una colposcopia. Para evitar el sesgo, se aplicó el procedimiento de doble ciego con las participantes en el estudio y los especialistas en colposcopia a la hora de realizar todas las pruebas del HPV y de comunicar los resultados citológicos hasta después de la colposcopia. La colposcopia se realizó según el protocolo estándar que determina la realización de biopsias de todas las lesiones visibles; todas las pacientes para las que no se pudo visualizar una unión escamosa fueron sometidas a un legrado endocervical y se realizó una biopsia cervical aleatoria en caso de no observarse lesiones. Todas las biopsias fueron evaluadas por un CPRP formado por tres patólogos expertos; los resultados discordantes se resolvieron de acuerdo con un protocolo predefinido. Para cada tipo de muestra, se midió el rendimiento clínico (sensibilidad y especificidad) de la prueba cobas® 4800 HPV y de la prueba COBAS® HPV para su uso en los sistemas cobas® 6800/8800 en comparación con los resultados histológicos del CPRP. Se realizaron análisis para las mujeres con una histología ≥ CIN2 según el panel CPRP. Se analizaron un total de 995 muestras recogidas en PreservCyt® (Tabla 20) y 841 muestras recogidas en SurePath™ (Tabla 21) procedentes de la prueba clínica con valoración de la histología completada. Se encontraron 65 mujeres con diagnóstico histológico de ≥ CIN2.

Tabla 20. Rendimiento de la prueba COBAS® HPV y la prueba cobas® 4800 HPV para la detección de ≥ CIN2 en PreservCyt®

IC = Intervalo de confianza.

Tabla 21. Rendimiento de la prueba COBAS® HPV y la prueba cobas® 4800 HPV para la detección de ≥ CIN2 en SurePath™

IC = Intervalo de confianza.

Concordancia entre la prueba COBAS® HPV en SurePath™ y PreservCyt® con comparador compuesto:

Se evaluó la concordancia entre los resultados de la prueba COBAS® HPV y un comparador compuesto consistente en resultados de ADN de HPV obtenidos mediante Qiagen Hybrid Capture 2 (hc2; sonda de genotipos de alto riesgo) y la prueba cobas® 4800 HPV. Un resultado positivo tanto de la prueba cobas® 4800 HPV como de los ensayos hc2 se definió como positivo para el comparador compuesto, un resultado negativo tanto de la prueba cobas® 4800 HPV como de hc2 se definió como negativo para el comparador compuesto; las muestras con resultados discordantes entre los dos métodos se consideraron indeterminadas y no se utilizaron para el cálculo de la concordancia de positivos, negativos y global.

El porcentaje de concordancia de positivos, negativos y global se calculó para cada tipo de medio de recogida frente al comparador compuesto. El análisis final de los datos incluyó los resultados de la prueba COBAS® HPV y el comparador compuesto de 2318 muestras recogidas en PreservCyt® (Tabla 22) y 1651 muestras recogidas en SurePath™ (Tabla 23).

Tabla 22. Concordancia entre la prueba COBAS® HPV y el comparador compuesto (hc2 en PreservCyt® y cobas® 4800 HPV en PreservCyt®) para muestras recogidas en PreservCyt®

IC = Intervalo de confianza, PCN = Porcentaje de concordancia de negativos, PCG = Porcentaje de concordancia global, PCP = Porcentaje de concordancia de positivos.

* Resultados de hc2 y la prueba cobas® 4800 HPV no coincidentes. Se obtuvieron tres resultados no válidos con la prueba COBAS® HPV.

Tabla 23. Concordancia entre la prueba COBAS® HPV y el comparador compuesto (hc2 en PreservCyt® y cobas® 4800 HPV en SurePath™) para muestras recogidas en SurePath™

IC = Intervalo de confianza, PCN = Porcentaje de concordancia de negativos, PCG = Porcentaje de concordancia global, PCP = Porcentaje de concordancia de positivos.

* Resultados de hc2 y cobas® 4800 HPV no coincidentes.

INSTRUCCIONES DE USO:

Suspensión de muestras de autotoma:

Instrucciones para la suspensión de muestras obtenidas con Copan FLOQSwabs® para la autotoma de muestras vaginales (552C.80)

Instrucciones para la manipulación de muestras de autotoma obtenidas mediante hisopos Copan FLOQSwabs® para la autotoma vaginal (552C.80) y su análisis con las pruebas cobas® 4800 HPV o COBAS® HPV.

La muestra de autotoma debe introducirse en un medio después de su obtención.

• Lea todas las instrucciones antes de iniciar la suspensión de la muestra.

• Siga las instrucciones de uso del fabricante del dispositivo de obtención para obtener la muestra.

• Una vez obtenida, proceda con las siguientes instrucciones para conservar la muestra:

Manipule con cuidado la muestra obtenida.

Glosario:

Instrucciones para la suspensión de muestras obtenidas con Rovers Evalyn® Brush:

Instrucciones para la manipulación de muestras de autotoma obtenidas mediante Rovers Evalyn® Brush para el análisis con las pruebas cobas® 4800 HPV o COBAS® HPV.

La muestra de autotoma debe introducirse en un medio después de su obtención.

• Lea todas las instrucciones antes de iniciar la suspensión de la muestra.

• Siga las instrucciones de uso del fabricante del dispositivo de obtención para obtener la muestra.

• Una vez obtenida, proceda con las siguientes instrucciones para conservar la muestra:

Manipule con cuidado la muestra obtenida.

Glosario:

Muestras en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt®:

Sistema cobas® 5800:

• El sistema cobas® 5800 puede procesar muestras en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt® directamente en los recipientes primarios si tienen un código de barras adecuado o desde un tubo secundario cobas® etiquetado debidamente con un código de barras (consulte el apartado sobre sistemas cobas® 5800/6800/8800 más abajo para conocer instrucciones de alicuotado adicionales para el sistema cobas® 5800).

1. Con unos guantes limpios, agite cada vial primario tapado durante 10 segundos justo antes de cargarlo.

2. Destape el vial primario y colóquelo en un transportador de medio para la obtención de células.

• En el caso de la carga de viales primarios, el volumen mínimo necesario para los contenedores primarios es de 3,0 mL.

Sistemas cobas® 5800/6800/8800:

• Las muestras en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt® deben alicuotarse en tubos secundarios cobas® como se describe a continuación para su procesamiento en el sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800:

1. Prepare un tubo secundario cobas® de 13 mL con código de barras para cada muestra recogida en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt® que vaya a analizar.

2. Usando unos guantes limpios, vortee cada vial primario de muestra recogida en Roche Cell Collection Medium o PreservCyt® durante 10 segundos justo antes de realizar la transferencia.

3. Quite el tapón del vial primario y transfiera como mínimo 1,0 mL y como máximo 4,0 mL al tubo secundario con código de barras preparado en el paso 1. Extreme siempre la atención cuando transfiera las muestras de los contenedores primarios a los tubos secundarios. Utilice siempre una punta de pipeta nueva para cada muestra. Transfiera el tubo a un rack (o tape el tubo secundario cobas® si la prueba se va a realizar posteriormente).

4. Vuelva a tapar el vial primario con un tapón de repuesto antes de continuar con la muestra siguiente. Almacene el vial primario en posición vertical.

5. Cargue los racks de los tubos secundarios sin tapar en el sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800 para realizar la prueba HPV.

Muestras en fluido conservante SurePath™:

Sistemas cobas® 5800/6800/8800:

• Las muestras recogidas en SurePath™ deben someterse al tratamiento preanalítico que se describe a continuación antes de realizar la prueba COBAS® HPV.

1. Prepare un tubo secundario cobas® de 13 mL con código de barras* para cada muestra recogida en SurePath™ que vaya a analizar y transfiera alícuotas de 0,5 mL del buffer de preparación de muestras cobas® (CSPB) a cada tubo secundario.

2. Usando unos guantes limpios, agite cada vial primario de muestra recogida en SurePath™ durante 10 segundos justo antes de realizar la transferencia.

3. Quite el tapón del vial primario y transfiera 0,5 mL de muestra recogida en SurePath™ al tubo secundario cobas® con código de barras preparado en el paso 1. Extreme siempre la atención cuando transfiera las muestras de los contenedores primarios a los tubos secundarios. Utilice siempre una punta de pipeta nueva para cada muestra.

4. Tape el tubo secundario y vuelva a tapar el vial primario con un tapón de repuesto antes de continuar con la muestra siguiente. Almacene el vial primario en posición vertical.

5. Agite cada tubo secundario durante 1 segundo.

6. Transfiera los tubos a la unidad de calentamiento ajustada a 95°C e incube durante 20 minutos.

7. Retire los tubos y deposítelos en un rack de recogida. Déjelos enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Extreme la atención, puesto que los tubos secundarios pueden estar calientes.

8. Agite cada tubo secundario durante 5 segundos.

9. Destape los tubos y deseche los tapones. Transfiera los tubos a los racks y procéselos en el sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800 para realizar la prueba de HPV.

10. En caso necesario, las muestras recogidas en SurePath™ tratadas con el buffer de preparación de muestras cobas® pueden almacenarse para futuras pruebas de HPV. Después de seguir el procedimiento anterior hasta el paso 7, almacene los tubos con muestra recogidas en SurePath™ tratadas con buffer de preparación de muestras cobas® a una temperatura de 2-30°C hasta 6 semanas antes de realizar las pruebas HPV.

* Se requieren etiquetas de código de barras resistentes al calor para los tubos utilizados en el paso de calentamiento para revertir la reticulación inducida por la matriz.

Consulte el apartado “Material adicional para la preparación de muestras” para conocer los números de producto recomendados.

Notas sobre el procedimiento:

• No utilice la prueba COBAS® HPV, el COBAS® HPV Positive Control Kit, el cobas® Buffer Negative Control Kit ni ningún reactivo cobas® omni después de la fecha de caducidad.

• No reutilice el material fungible. Son de un solo uso.

• Asegúrese de que las etiquetas de código de barras de los tubos de muestras puedan verse a través de las aberturas laterales de los racks de muestras. Consulte la Asistencia al usuario del sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800 para conocer las especificaciones de códigos de barras adecuadas e información adicional sobre la carga de tubos de muestras.

• Consulte la Asistencia al usuario del sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800 para obtener información sobre el correcto mantenimiento de los instrumentos.

Ejecución de la prueba COBAS® HPV en el sistema cobas® 5800:

La prueba COBAS® HPV puede realizarse en el cobas® 5800 System con un volumen de muestra mínimo necesario de 3,0 mL para muestras en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt® del vial primario. Las alícuotas de muestras recogidas en Roche Cell Collection Medium y PreservCyt® en tubos secundarios cobas® pueden analizarse con un volumen necesario mínimo de 1,0 mL. Las muestras recogidas en SurePath™ sometidas a un procedimiento preanalítico en un tubo secundario cobas® tendrán un volumen de 1,0 ml. El procedimiento preanalítico para muestras recogidas en SurePath™ se describe en el apartado “Muestras en fluido conservante SurePath™”. El funcionamiento del instrumento se describe con detalle en la Asistencia al usuario del sistema cobas® 5800. En la Ilustración 1 se resume el procedimiento.

• Las muestras en Roche Cell Collection Medium y PreservCyt® pueden analizarse desde los viales primarios. Agite cada muestra durante 10 segundos justo antes de cargarlas.

Nota: Aplique movimientos lentos y constantes para cargar y descargar el transportador de contenedores de medio de recogida (sujetando los viales primarios) para evitar salpicaduras en las muestras.

• Opcionalmente, las muestras pueden alicuotarse en tubos secundarios cobas® de 13 mL con código de barras para su procesamiento en el sistema cobas® 5800. Utilice pipetas con puntas con filtro para aerosol o desplazamiento positivo para manipular las muestras.

• En una sola serie pueden combinarse muestras de varios tipos (recogidas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® y/o fluido conservante SurePath™) y diferentes tipos de contenedores de muestra (primarios o secundarios) y cada una de ellas puede analizarse con los ASAP del HPV de alto riesgo (HPV-AR) o del HPV de alto riesgo más genotipado (HPV-GT).

• Las muestras deben procesarse utilizando la selección de tipo de muestra de la interfaz de usuario (IU) de la prueba COBAS® HPV como se describe en la Tabla 16.

• Se requieren etiquetas de código de barras resistentes al calor para los tubos utilizados con muestras recogidas en fluido conservante SurePath™.

• Se pueden realizar anotaciones en las peticiones de pruebas utilizando el software del instrumento. Consulte la Asistencia al usuario del sistema cobas® 5800 para conocer las instrucciones de anotación.

Tabla 16. Selección del tipo de muestra para COBAS® HPV en el sistema cobas® 5800

Ilustración 1. Procedimiento de la prueba COBAS® HPV en el sistema cobas® 5800

Ejecución de la prueba COBAS® HPV en los sistemas cobas® 6800/8800:

La prueba COBAS® HPV puede ejecutarse con un volumen de muestra mínimo de 1,0 mL con muestras recogidas en Roche Cell Collection Medium y solución PreservCyt®, así como con muestras recogidas en SurePath™ que han sido sometidas al procedimiento preanalítico. El procedimiento preanalítico se describe en la página siguiente. El funcionamiento del instrumento se describe con detalle en la Guía del usuario de los sistemas cobas® 6800/8800. En la Ilustración 2 se resume el procedimiento.

• Es necesario transferir alícuotas de las muestras a tubos secundarios de cobas® de 13 mL con código de barras a fin de procesarlas en los sistemas cobas® 6800/8800. Utilice pipetas con puntas con filtro para aerosol o desplazamiento positivo para manipular las muestras.

• En una sola serie pueden combinarse muestras de varios tipos (recogidas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® y/o fluido conservante SurePath™) y cada muestra puede analizarse con los ASAP del HPV de alto riesgo (HPV-AR) o del HPV de alto riesgo más genotipado (HPV-GT).

• Las muestras deben procesarse utilizando la selección de tipo de muestra de la interfaz de usuario (IU) de la prueba COBAS® HPV como se describe en la Tabla 17.

• Se requieren etiquetas de código de barras resistentes al calor para los tubos utilizados con muestras recogidas en fluido conservante SurePath™.

• Se pueden realizar anotaciones en las peticiones de pruebas utilizando el software del instrumento. Consulte la Guía del usuario de los sistemas cobas® 6800/8800 para obtener instrucciones sobre la anotación.

Tabla 17. Selección del tipo de muestra en la interfaz de usuario de COBAS® HPV

Ilustración 2. Procedimiento de la prueba COBAS® HPV en los sistemas cobas® 6800/8800

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO:

• La prueba COBAS® HPV se ha evaluado para ser utilizada únicamente en combinación con el COBAS® HPV Positive Control Kit, el cobas® Buffer Negative Control Kit, el cobas® omni MGP Reagent, el cobas® omni Lysis Reagent, el cobas® omni Specimen Diluent y el cobas® omni Wash Reagent en los sistemas cobas® 5800/6800/8800.

• La prueba COBAS® HPV se ha validado para su uso con muestras cervicales recogidas en Roche Cell Collection Medium, solución PreservCyt® y fluido conservante SurePath™. No se ha validado el rendimiento del ensayo para su uso con otros medios de recogida y/o tipos de muestras. El uso de otros medios de recogida y/o tipos de muestra puede causar falsos positivos, falsos negativos o resultados no válidos.

• La prueba COBAS® HPV se ha validado para el análisis de muestras vaginales recogidas con FLOQSwabs® para autotoma vaginal y Evalyn Brush® y suspendidas posteriormente en Roche Cell Collection Medium o solución PreservCyt®. No se ha validado el rendimiento del ensayo para su uso con otros medios de recogida y/o dispositivos de recogida. El uso de otros medios de recogida y/o dispositivos de recogida puede causar falsos positivos, falsos negativos o resultados no válidos.

• La prueba COBAS® HPV está validada para el análisis de muestras cervicales recogidas en fluido conservante SurePath™ tratadas con buffer de preparación de muestras cobas® para revertir la reticulación inducida por la matriz de las muestras recogidas en fluido conservante SurePath™. Si el procesamiento de las muestras recogidas en fluido conservante SurePath™ se realiza sin seguir el protocolo de pretratamiento con buffer de preparación de muestras cobas® o si el pretratamiento se realiza con reactivos alternativos, pueden originarse falsos negativoso resultados no válidos.

• La prueba COBAS® HPV detecta ADN de los genotipos de alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68. Esta prueba no detecta ADN de genotipos del HPV de bajo riesgo (p. ej., 6, 11, 42, 43, 44), ya que el análisis de dichos genotipos de HPV de bajo riesgo carece de utilidad clínica.18

• La prueba COBAS® HPV para la detección de los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68 del virus del papiloma humano no se recomienda para la determinación de presuntos abusos sexuales u otras indicaciones de ámbito médico o jurídico.

• La detección de HPV de alto riesgo depende del número de copias presentes en la muestra, que puede verse afectado por el método de obtención de la muestra, los factores propios de la paciente, la fase de infección y la presencia de sustancias interferentes.

• La prevalencia de la infección por HPV en una población puede alterar el resultado. Los valores de predicción positivos disminuyen cuando las pruebas se realizan en poblaciones con una prevalencia baja o en pacientes sin riesgo de infección.

• La infección por HPV no es indicativa de HSIL en la citología ni de CIN de alto grado subyacente, así como tampoco de un posible desarrollo de CIN2-3 o cáncer. La mayoría de las mujeres infectadas por uno o más tipos de alto riesgo del HPV no llegan a desarrollar CIN2-3 ni cáncer.

• Un resultado negativo para HPV de alto riesgo no excluye la posibilidad de futuros resultados de HSIL citológicos ni de lesiones CIN2-3 o cáncer subyacente.

• La amplificación y detección de la β-globina humana se incluye en la prueba COBAS® HPV con objeto de diferenciar las muestras negativas para HPV de las que no presentan señal para HPV debido a un volumen de células insuficiente en la muestra. Todas las muestras negativas para HPV deben generar una señal para β- globina válida comprendida en un rango predefinido para poderlas identificar como muestras negativas válidas.

• La obtención de resultados fiables depende de que los procedimientos de recogida, almacenamiento y manipulación de muestras sean adecuados.

• La incorporación de la enzima AmpErase a la Master Mix para la prueba COBAS® HPV permite realizar una amplificación selectiva del ADN diana; no obstante, es imprescindible utilizar buenas prácticas de laboratorio y cumplir estrictamente los procedimientos especificados en estas Instrucciones de uso para evitar la contaminación de los reactivos.

• El uso de este producto debe limitarse al personal con experiencia en el empleo de técnicas de PCR y la utilización del sistema cobas® 5800 y/o de los sistemas cobas® 6800/8800.

• Debido a las diferencias específicas entre tecnologías, se recomienda a los usuarios que realicen estudios de correlación en el laboratorio para determinar las diferencias tecnológicas antes de cambiar de una a otra. No cabe esperar una concordancia de porcentaje del 100% entre los resultados debido a las diferencias entre tecnologías indicadas anteriormente y a la variabilidad intrínseca de las pruebas.

• Tampoco se han evaluado los efectos de otras variables potenciales como la descarga vaginal, el uso de tampones, la ducha, etc., y las variables que afectan a la obtención de las muestras.

• Aunque es poco probable, las mutaciones en las regiones muy conservadas del ADN genómico del virus del papiloma humano cubiertas por los cebadores y/o las sondas de la prueba COBAS® HPV pueden causar errores en la detección del ADN vírico.

• La presencia de inhibidores de la PCR puede dar lugar a resultados de falsos negativos o resultados no válidos.

• Los productos que contienen carbómeros, incluidos los lubricantes, las cremas y los geles vaginales, pueden interferir con la prueba y no deberían utilizarse ni antes ni durante la obtención de las muestras. Consulte los resultados de interferencia para obtener más información (Tabla 35).

• Los resultados negativos en la prueba del HPV no pretenden evitar que las mujeres se sometan a una colposcopia.

• Los resultados positivos indican la presencia de uno o más tipos de alto riesgo. Sin embargo, puesto que las pacientes pueden estar infectadas también con tipos de bajo riesgo, no se puede descartar la presencia de tipos de bajo riesgo en pacientes con infecciones mixtas.

• Los resultados de esta prueba solo deben interpretarse junto con la información disponible de la evaluación clínica del paciente y de su historial.

INFORMACIÓN ADICIONAL:

Características principales del ensayo:

Símbolos:

Los símbolos siguientes se emplean en el rotulado de todos los productos de diagnóstico por PCR de Roche.

Tabla 41. Símbolos utilizados en las etiquetas de los productos para diagnóstico mediante PCR de Roche

Asistencia técnica:

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Puede consultar el resumen del informe de seguridad y rendimiento en el siguiente enlace: https://ec.europa.eu/tools/eudamed

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RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA:

Información de referencia: Las infecciones persistentes por el virus del papiloma humano (HPV) son la principal causa de cáncer cervical y de su afección precursora, la neoplasia intraepitelial cervical (CIN).1-3 La presencia de HPV está relacionada con más de un 99% de los casos de cáncer cervical en todo el mundo.3 El HPV es un virus de ADN bicatenario pequeño sin envoltura con un genoma de unos 8.000 nucleótidos. Existen más de 140 genotipos de HPV4, 5 distintos, y unos 40 tipos distintos que pueden infectar la mucosa anogenital humana.6, 7 Sin embargo, se ha demostrado que únicamente un subconjunto de 14 genotipos del HPV es causante de la mayoría de los casos de cáncer cervical y lesiones cervicales precancerosas.3, 8-13 En este documento, “HPV” significa “HPV de alto riesgo”, salvo si se indica lo contrario.

En los países desarrollados en los que se aplican programas de detección de cáncer cervical, la citología (prueba de Papanicolaou) se utiliza desde la década de los 60 como herramienta principal para detectar síntomas precursores del cáncer cervical. A pesar de que se ha reducido drásticamente la incidencia y la tasa de mortalidad por cáncer cervical en estos países, la citología es una prueba costosa que conlleva la realización de varias pruebas en intervalos breves de tiempo. Además, para la interpretación de los resultados se requieren citopatólogos con gran experiencia, la reproducibilidad de la prueba es limitada y su sensibilidad relativamente baja para la detección de lesiones precancerosas. El descubrimiento del HPV persistente como el agente causante individual del cáncer cervical generó gran interés en el uso del HPV como herramienta de cribado de cáncer cervical y estudios posteriores han demostrado que las pruebas basadas en el HPV son más sensibles que la citología para la detección de lesiones precancerosas.14 En 2001, las directrices profesionales recomendaron por primera vez el uso de las pruebas del HPV en combinación con la citología en mujeres ≥ 21 años y, en 2012, la prueba conjunta (citología más prueba del HPV) se designó como el método preferido para el cribado de cáncer cervical en mujeres ≥ 30 años.15 Más recientemente, en 2014, la prueba cobas® 4800 HPV obtuvo la certificación de la FDA como método de cribado primario de primera línea y, en 2015, dos asociaciones profesionales publicaron unas directrices provisionales que designaban el cribado primario del HPV como una opción para el cribado de mujeres ≥ 25 años.16

Motivos para el uso de la prueba del HPV:

La mayoría de los casos de cáncer cervical y mortalidad pueden evitarse gracias a la detención temprana de cambios precancerosos en el cérvix. La citología Pap ha sido fundamental en los programas de cribado de cáncer cervical durante más de 50 años y ha contribuido a un descenso del 70% en las tasas de cáncer de cuello uterino en los países desarrollados.15 En la actualidad, el HPV se reconoce como una única causa imprescindible para el cáncer del cuello uterino y está presente en el 99,7% de los casos de cáncer cervical.3 Hay 13 genotipos del HPV clasificados como carcinogénicos o de alto riesgo (AR) debido a su asociación con el cáncer cervical: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, y un genotipo adicional (66) clasificado como probable carcinogénico.17 Por lo tanto, se ha incrementado el uso de pruebas que detectan la infección por estos genotipos AR del HPV en los programas de cribado de cáncer cervical. En las directrices “2006 Consensus Guidelines for the Management of Women with Abnormal Cervical Cancer Screening Tests”18 se estableció la conveniencia del uso de una combinación de citología cervical, pruebas para la detección de infección por HPV de AR y pruebas para la identificación del tipo específico del HPV para mujeres en cribado de cáncer cervical. En estas directrices, la temporización de estudios adicionales (p. ej., colposcopia) y el intervalo para la repetición del cribado dependen del resultados de estas pruebas. Estas directrices se han revisado recientemente y ahora recomiendan la combinación de la citología y las pruebas de HPV de AR (prueba conjunta) como el método preferido de cribado, con la opción añadida de las pruebas para la detección de los genotipos 16/18 del HPV.15 Las pruebas basadas en el HPV constituyen un método más sensible para el cribado de cáncer cervical que la citología19 y su valor médico ha sido claramente demostrado como ayuda para la citología, la clasificación de la citología de ASCUS y como prueba de primera línea.

Explicación de la prueba:

El ensayo COBAS® HPV es una prueba cualitativa de PCR a tiempo real20,21 capaz de detectar los 14 genotipos de HPV de alto riesgo. La prueba COBAS® HPV utiliza cebadores para definir una secuencia de aproximadamente 200 nucleótidos en la región L1 polimórfica del genoma del HPV. La Master Mix incluye un pool de cebadores para el HPV diseñados para amplificar el ADN del HPV de los 14 tipos de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68).3,9-13,22 La prueba utiliza ADN de β-globina como control interno para monitorizar todo el proceso de preparación de las muestras y amplificación mediante PCR, por lo que un par de cebadores adicional se dirige al gen de la β-globina humana (amplicón de 330 pares de bases). Las sondas de oligonucleótidos fluorescentes se unen a las regiones polimórficas de la secuencia definida por dichos cebadores. Además, la prueba utiliza un control positivo de título bajo y un control negativo.

La prueba COBAS® HPV se basa en la preparación de muestras totalmente automática (extracción y purificación de ácidos nucleicos) seguida de un proceso de amplificación23 y detección mediante PCR. El sistema cobas® 5800 se ha diseñado como un único instrumento integrado. Los sistemas cobas® 6800/8800 constan de un módulo de suministro de muestras, módulo de transferencia, módulo o módulos de procesamiento y módulo analítico, todos ellos integrados para formar un solo instrumento. La gestión automática de los datos se realiza mediante el software del sistema cobas® 5800 o los sistemas cobas® 6800/8800, que asigna los resultados a las pruebas como positivos, negativos o no válidos. Los resultados pueden revisarse directamente en la pantalla del sistema, exportarse o imprimirse como informe.

La extracción de ácidos nucleicos (ADN) de las muestras de pacientes y los controles externos se realiza simultáneamente. En resumen, los ácidos nucleicos se liberan al añadir proteinasa y reactivo de lisis a la muestra. Los ácidos nucleicos liberados se unen a la superficie de sílice de las partículas de vidrio magnéticas añadidas. Las sustancias sin unir y las impurezas, como las proteínas desnaturalizadas, los restos celulares y los posibles inhibidores de la PCR se eliminan en los siguientes pasos de lavado, mientras que los ácidos nucleicos purificados se eluyen de las partículas de vidrio magnéticas mediante el buffer de elución a temperatura elevada.

Para el proceso de amplificación mediante PCR se utiliza una enzima ADN polimerasa termoestable. La amplificación de las secuencias de HPV y β-globina se realiza simultáneamente mediante un perfil universal de amplificación mediante PCR que incluye unos pasos de temperatura y número de ciclos predefinidos. El reactivo de Master Mix incluye trifosfato de deoxiuridina (dUTP), en lugar de trifosfato desoxitimidina (dTTP), que se incorpora al ADN recién sintetizado (amplicón). La enzima AmpErase, que se incluye en la Master Mix para PCR cuando se calienta durante la primera ciclación térmica, elimina cualquier amplicón contaminado de las series de PCR anteriores.24 Sin embargo, no se eliminan los amplicones nuevos porque la enzima AmpErase se inactiva cuando se expone a temperaturas superiores a los 55 °C.

La Master Mix para la prueba COBAS® HPV contiene sondas de detección específicas para doce secuencias diana de HPV de alto riesgo, una sonda de detección específica para la secuencia de la diana del HPV16, una sonda de detección específica para la secuencia de la diana del HPV18 y una para la β-globina. La señal amplificada de los doce genotipos de HPV de alto riesgo (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) se detecta con el mismo marcador fluorescente, mientras que las señales de los genotipos HPV16 y HPV18 y de la β-globina se detectan con marcadores fluorescentes específicos. Cuando no se une a la secuencia de la diana, la señal fluorescente de las sondas intactas se elimina mediante el marcador silenciador. Durante el paso de amplificación mediante PCR, la hibridación de las sondas con la plantilla específica de ADN monocatenario provoca la escisión de la sonda por la actividad de la exonucleasa 5’ a 3’ de la ADN polimerasa, lo que produce la separación de los marcadores emisor y silenciador y la emisión de una señal fluorescente. Con cada ciclo de PCR, se generan cantidades crecientes de sondas escindidas y la señal acumulada del marcador emisor aumenta concomitantemente. La detección y diferenciación en tiempo real de los productos de PCR se consigue mediante cuantificación de la fluorescencia liberada por los marcadores emisores para las dianas de HPV y β-globina, respectivamente.